如今神經(jīng)毒性檢測(cè)主要是依賴活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不僅有倫理問題，而且通常非常昂貴并且十分耗時(shí)。當(dāng)需要大規(guī)模的測(cè)試化合物的時(shí)候就不太合適了。因此，高通量的體外的神經(jīng)毒性測(cè)試就顯得十分必要了，而且可以使用人源的細(xì)胞直接進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性也更佳。但是，到目前為止，人源干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元并沒有適合進(jìn)行這類試驗(yàn)的特質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，批次間差異大，并且有收到倫理和一些法律的制約，使得這種細(xì)胞都不太適用于做大規(guī)模的體外測(cè)試試驗(yàn)。近，市面上出現(xiàn)了商用的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞，重復(fù)性好，可以用來(lái)做這類的體外神經(jīng)毒性試驗(yàn)。

荷蘭的科學(xué)家使用人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞做了免疫熒光染色試驗(yàn)，作為高通量進(jìn)行體外的神經(jīng)細(xì)胞毒性檢測(cè)的預(yù)試驗(yàn)。由不同供應(yīng)商提供的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞混合培養(yǎng)能夠形成不同（激活型或抑制型）神經(jīng)元共培養(yǎng)的樣本。

ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091

Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?

Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.

一、實(shí)驗(yàn)材料

1）細(xì)胞： iCell^® Neurons （NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）

          CDI iCell® Astrocytes（Cellular Dynamics international）

          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)

          DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    

2）培養(yǎng)基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)

3）試劑： Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）

4）培養(yǎng)耗材：µ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）

二、實(shí)驗(yàn)方法

一）載玻片包被

①　每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液

②　室溫孵育60分鐘

③　吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用

二）免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1）鋪細(xì)胞：

iCell^® Neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞

iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪66000個(gè)細(xì)胞

HIP neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞

DOPA.4U® neurons 每孔鋪52000個(gè)細(xì)胞

DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪48000個(gè)細(xì)胞

2）加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

5）依次加入一抗，二抗進(jìn)行免疫熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察（圖二）。

圖二：圖示鋪細(xì)胞，固定，清洗，染色步驟。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖三：iPSC-derive神經(jīng)元的免疫熒光染色結(jié)果。不同種類的人源iPSC-derive神經(jīng)元使用β(III)tubulin（綠色）和GFAP（紅色），用來(lái)區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞（HIP® neurons, 左上；DOPA.4U® neurons，左下；iCell neurons，右上。） Human iCell 神經(jīng)元用vGAT (綠色) 和vGluT (紅色)確定抑制或激活突觸（右下）。細(xì)胞核使用DAPI染色（藍(lán)色）。